用臭氧水浸泡和喷雾方法杀灭沙门氏菌的研究

用臭氧水浸泡和喷雾方法杀灭沙门氏菌的研究

        臭氧 (O3) 是家禽加工业中一种有吸引力的替代抗菌剂。对改善食品安全问题的 O3 很佳操作条件知之甚少。因此，本研究的主要目的是使用顺序浸泡和喷洒方法来表征在不同操作条件下对高沙门氏菌污染鸡腿的微生物杀灭能力。将四百四十八根鸡腿（280-310 g）浸泡在两株沙门氏菌混合物中，皮肤表面的初始负荷为 6.9-log10 细胞形成单位（CFU）/cm2 [95% 置信区间（ CI），6.8-7.0]。然后将受污染的鼓槌依次（10 倍）浸泡并喷洒 O3 水溶液（8 ​​ppm）和 O3-LA。在 O3 暴露后，使用 3MTM PetrifilmTM 快速需氧计数板 (RAC) 和读板器对每个鼓槌的浸泡后和喷洒后的水、皮肤表面和皮下 (SC) 进行定量细菌培养。水性 O3/循环对皮肤表面的平均杀灭能力为 1.6-log10/cm2（95% CI，1.5-1.8-log10/cm2）和 1.2-log10/cm2（95% CI，1.0-1.4-log10/cm2） ), 浸泡和喷洒方法的 SC 分别为 1.1-log10/cm2 (95% CI, 0.9–1.3-log10/cm2) 和 0.9-log10/cm2 (95% CI, 0.7–1.1-log10/cm2),分别。使用 8 ppm 的臭氧水进行六次连续浸泡和七次连续喷洒循环，将沙门氏菌的重载量分别降低到皮肤表面和鼓槌 SC 的可检测极限以下。添加 LA 似乎增加了 O3 水溶液的微生物杀灭能力，使用浸泡和喷洒方法在皮肤表面的平均差异分别为 0.3-log10/cm2 (P = 0.08) 和 0.2-log10/cm2 (P = 0.12)。含水 O3 不会引起鼓槌皮肤颜色的任何显着变化。 < 4.5-log10/cm2 的沙门氏菌负荷是减少率的强预测因子（P < 0.001，R2 = 0.64）。这些结果提供了重要信息，有助于家禽加工设施选择 O3 作为有效抗菌剂的很佳操作策略。

介绍

        鸡肉是世界上第二受欢迎的肉类，占肉类总产量的 30%，其次是猪肉，占肉类总产量的 38%。在美国，禽肉是很受欢迎的消费肉类，近年来消费量稳步增长。人均年禽肉消费量从 1970 年的 27 磅增加到 2005 年的 60 磅（国家鸡肉委员会，2011 年）。这种肉类受欢迎的原因是具有竞争力的价格、没有文化和宗教障碍、制作速度快、脂肪含量低以及营养价值高（联合国粮食及农业组织 [FAO]，2014 年）。多年来，鸡肉市场已经从整只鸡变成了鸡块。在过去的几十年中，83% 的肉鸡作为整只鸡销售，而 15% 作为部分销售。 2009 年，12% 的肉鸡作为整鸡食用，42% 作为部分食用（国家养鸡委员会，2011）。鸡肉由于含水量高、大量可变营养素和高 pH 值导致产品保质期短而支持细菌生长（Lawrie，1998 年）。在过去的几年里，消费者比以往任何时候都更加关注食品安全。美国农业部、食品安全和检验局 (USDA-FSIS) 的建议是控制消费者很常购买的产品中的病原体流行率（美国农业部、食品安全和检验局，2015 年）。新标准包括在冷藏线末端和切割间培养食源性病原体（美国农业部、食品安全和检验局，2015 年）。

        在美国，食源性疾病每年导致 800 万例病例、128,000 人住院和 3,000 人死亡（疾病控制和预防中心，2011 年）。根据增强型疾病成本模型计算的疾病年度经济总负担为 777 亿美元（Scharff，2012 年）。沙门氏菌是美国很常报告的食源性疾病原因，每年约有 120 万例病例，约 20,000 人住院，约 400 人死亡（Scallan 等，2011）。包括医疗费用和生产力损失在内的年度总成本估计约为 33 亿美元（Hoffmann 等人，2012 年）。沙门氏菌是很常见的与禽肉和禽肉制品相关的病原体（Hoffmann 等，2012）。因此，它被认为是家禽加工设施卫生条件的良好指标（Kottwitz 等，2010；Silva 等，2010；Jakobsen 等，2012）。当微生物数量达到 106-109 个细胞形成单位 (CFU)/cm2 时，鸡胴体被认为变质或变质（Russell，2001 年）。因此，安全消除或至少降低到安全水平是家禽加工设施面临的直接挑战。目前，在屠体加工过程中，通过结合使用热处理、水和化学抗菌剂（如过氧乙酸 (PAA)）来去除或控制细菌污染（Northcutt 等人，2005 年；Dittoe 等人，2019 年）。然而，这些化学抗菌剂面临着挑战，包括持续数小时，其中大多数在分解前后都可能有毒（Megahed 等，2018a，b，2019）。此外，这些化学抗菌剂会产生不希望的颜色和质地效果，并产生异味（Qiao et al., 2002）。因此，使用具有高杀灭能力、短半衰期和分解为无毒分子的其他抗微生物剂是家禽业的优先目标。

        在美国，食源性疾病每年导致 800 万例病例、128,000 人住院和 3,000 人死亡（疾病控制和预防中心，2011 年）。根据增强型疾病成本模型计算的疾病年度经济总负担为 777 亿美元（Scharff，2012 年）。沙门氏菌是美国很常报告的食源性疾病原因，每年约有 120 万例病例，约 20,000 人住院，约 400 人死亡（Scallan 等，2011）。包括医疗费用和生产力损失在内的年度总成本估计约为 33 亿美元（Hoffmann 等人，2012 年）。沙门氏菌是很常见的与禽肉和禽肉制品相关的病原体（Hoffmann 等，2012）。因此，它被认为是家禽加工设施卫生条件的良好指标（Kottwitz 等，2010；Silva 等，2010；Jakobsen 等，2012）。当微生物数量达到 106-109 个细胞形成单位 (CFU)/cm2 时，鸡胴体被认为变质或变质（Russell，2001 年）。因此，安全消除或至少降低到安全水平是家禽加工设施面临的直接挑战。目前，在屠体加工过程中，通过结合使用热处理、水和化学抗菌剂（如过氧乙酸 (PAA)）来去除或控制细菌污染（Northcutt 等人，2005 年；Dittoe 等人，2019 年）。然而，这些化学抗菌剂面临着挑战，包括持续数小时，其中大多数在分解前后都可能有毒（Megahed 等，2018a，b，2019）。此外，这些化学抗菌剂会产生不希望的颜色和质地效果，并产生异味（Qiao et al., 2002）。因此，使用具有高杀灭能力、短半衰期和分解为无毒分子的其他抗微生物剂是家禽业的优先目标。

        臭氧 (O3) 以其强氧化能力而闻名，其氧化电位为 2.07 V，几乎是氯的氧化电位 (1.36) 的两倍，并且高于 PAA (1.81) 的氧化电位 (Russel 等人，1999)。由于 O3 具有很强的氧化电位，即使在浓度低至 0.01 ppm 的情况下，O3 对细菌也具有很强的毒性（Qingshi 等人，1989 年）。此外，O3 对家禽产品的很终外观没有任何负面影响（Mancini 和 Hunt，2005）。 2002 年，美国农业部批准 O3 作为用于肉类和家禽生产的安全和合适的成分（美国农业部，2002）。 1979 年，Yang 和 Chen 报道，在 2.48 ppm 的臭氧水中浸泡 9 分钟，鸡脖子上的微生物减少约 3-log10（Yang 和 Chen，1979）。在另一项研究中，臭氧水在暴露时间为 45 分钟的含 3.0-4.5 ppm O3 的水中冷却的鸡胴体上没有显示出显着的微生物减少率（1-log10）（Sheldon 和 Brown，1986 年）。这表明O3水溶液对沙门氏菌污染鸡胴体的微生物杀灭能力仍是一个悬而未决的问题。在潜在的去污方案中，有机酸溶液和氧化剂的混合物已经对家禽产品进行了评估，并显示出不同的结果。乳酸 (LA) 和 PAA 的组合可将鲜切叶菜中的大肠杆菌 O157 和有机物质降低到安全水平（Haute 等人，2015 年）。据我们所知，没有研究评估 O3-LA 的组合用于降低鸡切块中的病原体流行率和水平。因此，本研究的主要目的是使用顺序浸泡和喷洒方法来表征不同操作条件下水性 O3 和 O3-LA 混合物对被高沙门氏菌污染的鸡腿的微生物杀灭能力。我们还假设细菌负荷对 O3 水溶液的微生物杀灭能力有显着影响（Megahed 等人，2018a，b）。因此，次要目标是使用分段线性回归来确定皮肤表面微生物负荷对含水 O3 的微生物杀灭能力的影响。

臭氧发生器

        浓度为 8 ppm 的水性 O3 是使用如我们工作中先前所述制造的 OOG1 × 0臭氧发生器获得的（Megahed 等人，2018a，b，2019）。

顺序浸泡法

        本实验旨在使用多顺序浸泡方法表征水性 O3 和 O3-LA 对 aSTC 严重污染的鸡腿的微生物杀灭能力。将 50 个接种鼓槌随机分为四组，即 O3 水溶液处理 (n = 15)、O3-LA 处理 (n = 15)、阳性对照 (n = 15) 和阴性对照 (n = 5)。阴性对照鼓槌用于检测背景沙门氏菌的存在。用水性 O3 处理过的鼓槌依次用 500 ml 含有 8 ppm O3 的水浸泡（10 次连续洗涤），每次浸泡 4 分钟（Megahed 等人，2018a，b，2019）。为了确保 O3 的破坏，在循环之间执行 30 分钟的等待时间（Hirahara 等人，2019）。用 500 ml 含有 0.3% L-乳酸（Sigma Aldrich, St. Louis, MO, United States）的臭氧水依次浸泡（10 次连续洗涤）O3-LA 处理的鼓槌，暴露 4 分钟。选择 LA 的浓度以达到 2 至 3 的 pH 范围，以提供很佳条件以很大化 O3 的氧化能力（Van Netten 等，1994）。 500 ml 的体积被用作足以完全覆盖 WHIRL-PAK 袋中的鼓槌的很佳体积。臭氧水的温度为 10-12°C。在暴露期间轻轻摇动袋子。将阳性对照鼓槌用 500 ml 高压灭菌蒸馏水 (DW) 依次浸泡（10 次连续洗涤）相同的暴露时间。

        每个浸泡循环吸出两毫升浸泡水并用于培养。将 1 毫升直接涂抹在 RAC PetrifilmTM 板上，然后将 1 毫升在 9 毫升 BPW 中连续稀释（五倍稀释）。皮肤表面和 SC 的大约 6 cm2 区域也在每个浸泡周期的不同点用无菌棉签擦拭。每个拭子在 10 ml BPW 中洗涤，然后将 1 ml 在 9 ml BPW 中连续稀释（三倍稀释）。将每个稀释液中的一毫升涂在 RAC PetrifilmTM 板上。所有 RAC PetrifilmTM 板均在 37°C 下孵育 24 小时。每个稀释液中的一毫升也在 TSA 上生长，用于细菌鉴定，使用 MALDI-TOF 质谱法仅确认沙门氏菌分离物。使用自动计数器（3M Petrifilm Plate Reader；3MTM Microbiology, St. Paul, MN, United States）对菌落形成单位进行计数。将板再孵育 2-3 天以消除受损细胞恢复的影响。为了适应读板器的有效读取范围（很大读数 < 999/板），仅使用具有 30-300 个菌落的板来计算细菌减少因子 (RF)。

用蒸馏水（灰色）、臭氧8 ppm （蓝色）和臭氧-乳酸混合物（橙色）使用多顺序喷涂方法。垂直的蓝色虚线表示未检测到 aSTC。

结论

        使用 8 ppm 的臭氧水进行六次连续浸泡和七次连续喷洒循环提供了一种有效的安全方案，可将污染鸡部位皮肤表面和 SC 的沙门氏菌高负荷降低到可检测范围以下。 在臭氧水中添加 LA 似乎可以增强 O3 的去污能力。 细菌负荷是控制O3对鸡胴体表面微生物杀灭能力的重要因素。