pNaSS 通过臭氧化和接枝聚合接枝到PCL表面研究

        聚苯乙烯磺酸钠（pNaSS）通过臭氧化和接枝聚合接枝到聚（ε-己丙酮）（PCL）表面。研究了臭氧化和聚合时间以及接枝液中莫尔盐浓度对接枝程度的影响。通过甲苯胺蓝染色确定接枝程度。采用衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）、能量色散X射线光谱（EDX）和X射线光电子能谱（XPS）对表面化学变化进行了表征。结果表明，该接枝不会诱导PCL降解，并且pNaSS作为薄的共价稳定层嫁接到PCL上。此外，改性的PCL表面显示成纤维细胞的代谢活性显着增加，以及更好的细胞扩散和更高的粘附强度。因此，通过将一层薄薄的pNaSS固定在其表面上，PCL的生物活性大大增强。pNaSS的接枝是一种很有前途的方法，可以提高组织工程应用（如韧带重建）中使用的PCL基材料的生物活性。

1 引言

        组织工程的主要目标之一是开发可生物降解的支架，允许细胞在三维结构中粘附、增殖和分化。如果生物降解性方面通常促使选择α-羟基聚酯作为支架基质：脂肪族聚酯的主要缺点是缺乏促进良好细胞反应的细胞信号传导。为了克服聚酯材料遇到的化学成分问题，人们提出了多种改变材料表面的方法：通过表面处理引入极性基团、吸附生物分子和生物活性化合物的共价固定化[1\u20125]。与生物分子可以快速解吸的吸附方法相比，最后一种方法具有提高生物相容性的优点，同时具有一定的耐久性。然而，有许多因素会影响生物分子如何拴在表面，从而影响其生物活性[1]。此外，当使用糖胺聚糖等生物分子时，由于其异质性，很难理解生物分子对细胞增殖的影响。事实上，分子量、净电荷和离子基团分布的分散性可以显著影响生物反应[1,3]。此外，生物分子固定化的成本和控制仍然是控制细胞反应的关键步骤。因此，引入官能团是改变底物的电荷或化学组成表面的更简单方法，因此可以调节从细胞培养血清吸附到底物表面的蛋白质的重排[6]。

        通过阴离子和亲水性单体的接枝共聚来改性聚酯是一种众所周知的增强体外和体内细胞行为的通用方法。硫酸化大分子或单体已被广泛用于设计具有良好血液相容性和抗凝活性的聚合物生物材料[7]。有趣的是，研究发现，将聚苯乙烯磺酸钠（pNaSS）嫁接到聚乙烯基质上导致HeLa S3[8]和中国仓鼠卵巢细胞[9]的高度粘附。Kishida等[8]认为，靠近可电离磺酸盐基团的芳环的存在允许高蛋白吸附到pNaSS表面。最近，我们的研究小组证明，当pNaSS从聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）基合成韧带移植时，pNaSS允许更强的成纤维细胞粘附，更好的细胞扩散，更均匀的细胞分布在材料表面，并增加细胞胶原分泌[10\u201211]。当pNaSS从非聚合物生物材料表面接枝时，观察到相同的效果[12\u201215]。事实上，当pNaSS从钛表面接枝时，与天然钛表面相比，蛋白质吸附水平增加，吸附的蛋白质也受到选择性调节[12]。此外，MG63 [13] 或人间充质干细胞 [14] 的粘附及其在 pNaSS 移植表面上的扩散得到增强。此外，在pNaSS接枝表面发现了更好的碱性磷酸酶ALP活性和矿化，强调了pNaSS对成骨细胞分化的影响[14]。最后，当基于PET的合成韧带植入绵羊模型进行前交叉韧带重建时，pNaSS移植增强了韧带与骨的直接接触，减少了骨/韧带界面的纤维瘢痕组织[11,16]。因此，将pNaSS固定在组织工程应用中使用的三维支架中，特别是在韧带重建中，可以有效地调节细胞反应，并且似乎是更复杂生物分子共价固定的良好替代方案。

        然而，苯乙烯磺酸钠（NaSS）是一种阴离子乙烯基单体，由于被大水合球包围的高度电离磺酸基团与疏水性聚合物主链之间不相容，因此以其较差的聚合动力学而闻名[17]。到目前为止，pNaSS尚未共价嫁接到基于聚（ε-己内酯）（PCL）等合成聚酯的可生物降解支架上，除非我们小组最近的初步研究[18\u201219]。事实上，由于PCL是一种半结晶可生物降解聚合物，具有较低的特征温度（玻璃化转变温度约为-60°C，熔点温度在59至64°C之间[20–21]），因此只能在温和的条件下进行接枝，以避免PCL的降解以及热和机械性能的剧烈变化。因此，需要开发一种通用策略，允许从PCL中有效接枝pNaSS，同时保持pNaSS的生物活性和基于PCL的生物材料的内在特性。

        本研究研究了NaSS在PCL薄膜上的接枝聚合，研究了在各种反应参数下进行的接枝聚合：臭氧化和聚合时间，以及接枝液中莫尔盐的浓度。通过润湿性测量、衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）、能量色散X射线光谱（EDX）和X射线光电子能谱（XPS）证明了pNaSS接枝的证据。通过甲苯胺蓝染色确定接枝程度。通过测量细胞代谢活性和形态的体外测定评估了pNaSS接枝对成纤维细胞行为的影响。

2 材料与方法

2.1 材料

        PCL是从Sigma-Aldrich获得的。NaSS （Sigma-Aldrich） 在蒸馏水/乙醇溶液 （10/90 % （v/v）） 中重结晶纯化。使用莫尔盐、碘化钾和甲苯胺蓝 （BT） （Sigma-Aldrich） 未经任何纯化。所有溶剂均从Fisher购买，并按原样使用。磷酸盐缓冲盐水溶液 （PBS）、Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM）、青霉素-链霉素 （PenStrep） 和胎牛血清 （FBS） 由 Gibco 提供。MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑盐）、鬼笔环肽-FITC和Hoechst 33258购自Sigma。McCoy成纤维细胞购自ATCC（CRL-1696，美国）。

2.2 PCL薄膜的制备和pNaSS的接枝

        这些薄膜是使用旋涂法制造的。将二氯甲烷（60%（w / v））中的PCL溶液滴入载玻片上，然后使用SPIN150-v3 SPS以1500rpm旋转30秒。将薄膜风干2小时，然后真空干燥24小时以除去溶剂，最后将它们切成直径为~15.5mm的小圆盘。

        对于pNaSS接枝，将薄膜在室温下搅拌到蒸馏水中悬浮。臭氧发生器BMT 802N（ACW）产生臭氧，压力为0.5 bar，氧气流速为0.6 L min−1.臭氧化后，将PCL薄膜转移到含有莫尔盐的蒸馏水（15%（w/v））中的脱气NaSS溶液中。将系统保持在45°C以允许接枝聚合发生。聚合后，将样品用蒸馏水洗涤过夜，最后真空干燥。薄膜通过连续浸泡灭菌和制备，如下所示：在70%乙醇中2小时，在无菌PBS溶液中2小时，在DMEM中1小时，在完全培养基中1小时。

2.3 臭氧化和聚合后接枝pNaSS产生的过氧化物的定量测定

        PCL薄膜中臭氧化产生的过氧化物量通过分光光度法（碘化物法）测定[22]。将两片薄膜置于1 mL异丙醇和7 mL含有1 ppm-氯化铁的碘化钾溶液中，并在45°C下保持10分钟。反应后，立即使用分光光度计（Perkin Elmer Lambda 25）测量溶液在360nm处的吸光度，通过跟踪三碘化物阴离子浓度来测量氧化碘。该方法通过使用过氧化苯甲酰进行校准。过氧化物的密度以过氧化物摩尔/厘米表示2PCL薄膜。

通过BT与pNaSS磺酸基团的络合，通过比色法测定嫁接到PCL薄膜上的pNaSS的量。简而言之，将一层薄膜置于5mL BT溶液中，并在30°C下保持6小时。反应后，将络合的BT在室温下在10 mL乙酸溶液（50%（v））中解络24小时。此后，使用分光光度计（Perkin Elmer Lambda 25）在633nm处测量溶液的吸光度。该方法通过使用乙酸中的BT溶液进行校准。接枝密度（GD）以mol of pNaSS / cm表示2PCL薄膜。

2.4 PCL表征

        使用配备折光率检测器的 Spectra Physics P100 泵（Wyatt Technology Optilab Rex）使用尺寸排阻色谱 （SEC） 测定 PCL 数平均值和重均分子量（分别为 Mn 和 Mw）和多分散指数 （PDI）。针对每种薄膜条件分析两个样品。将样品溶解在四氢呋喃中，并通过2个混合C-13色谱柱（聚合物实验室）洗脱，这些色谱柱以1 mL min的流速串联连接−1.样品浓度为 10 mg mL−1并使用一系列窄多分散聚苯乙烯标准品生成常规校准。

        差示扫描量热法 （DSC） 分析在氮气气氛下使用 131 Seratam Instrumentation 量热仪进行。针对每种薄膜条件分析两个样品。在25至200°C的加热速率下，以10°C的最小加热速率扫描样品一次−1.熔融温度（Tm）和熔融焓（ΔHm）的PCL是从第一次扫描中确定的;熔化温度取于峰值的最大值。此后，在−100至25°C的加热速率下，以10°C的最小加热速率对样品进行两次扫描−1.玻璃化转变温度（Tg）在第二次扫描的中点确定。结晶度 （Xc） 使用公式 1 计算：

2.5 表面分析

接触角 （θ） 测量采用无柄跌落法，使用 Drop Shape Analysis 软件和 KRUSS 设备进行。使用的液体是蒸馏水，在不同位置对每个样品进行 3 次测量。针对每种薄膜条件分析两个样品。

傅里叶变换红外 （FTIR） 光谱以衰减全反射模式 （ATR） 记录，使用连接到 Thermo Nicolet Avatar 6700 FTIR 并由 OMNIC 软件控制的 SMART OMNIC 采样器获得。光谱是通过在 650 – 4000 cm 范围内累积 128 次扫描获得的−1分辨率为 4 cm−1.背景扫描是在没有样品的情况下采集的。

使用环境扫描电子显微镜（ESEM – Hitachi TM3000）进行能量色散X射线光谱（EDX）分析，该显微镜在15 kV的加速电压下工作，并配备EDX探头（Hitachi SwiftED3000）。采集时间设置为 196.6 s。针对每种薄膜条件分析了三个样品。

X射线光电子能谱（XPS）分析使用Surface Science Instruments S探针光谱仪进行。该仪器具有单色 Al Kα X 射线和低能电子泛光枪，用于中和非导电样品的电荷。起飞角度为55°。Service Physics Hawk Data Analysis 7 软件用于计算从测量和详细扫描中获取的峰面积的表面原子浓度，然后使用适当的元素敏感度系数进行校正，以及高分辨率扫描的峰值拟合。通过将最低结合能C1s高分辨率峰的结合能定为285.0 eV来校准高分辨率光谱的结合能尺度。对于成分分析，分析了每种样品类型的三个不同斑点。从每个样品的一个点采集高分辨率 C1s 扫描。

2.6 嫁接稳定性

为了研究pNaSS接枝的稳定性，将灭菌的薄膜浸入无菌PBS（pH = 7.1）中，并在37°C下在5%CO的加湿气氛中孵育2在空气中停留不同的时间段。在孵育结束时，监测PBS的pH值，并将样品在PBS中洗涤过夜。通过BT方法测定孵育膜上残留的接枝pNaSS的量，并根据公式2计算：

2.7 体外检测

灭菌后，将薄膜放置在 24 孔板的单个孔中，并用 PTFE 环称重。将McCoy细胞在37°C下以50,000个细胞/孔的细胞密度接种到薄膜上2小时。 随后，用补充了PenStrep（1%）和FBS（10%）的DMEM淹没了PTFE环上方的油井。培养24小时后，通过改良的MTT测定法测量细胞线粒体活性[24]。PBS 中的 MTT 溶液（5 mg mL−1）加入到每个孔中，然后在37°C下孵育4小时。 孵育期结束后，小心地取出薄膜并转移到装有 500 μL 二氯甲烷的玻璃瓶中。薄膜完全溶解后，加入500μL二甲基亚砜，并将样品在搅拌下放置过夜。使用分光光度计（Perkin Elmer Lambda 25）在550nm处测量光密度。在没有细胞的培养物中维持的薄膜并如上分析用于背景减法。这些胶片一式三份进行了测试。作为对照，将McCoy细胞接种在经过商业处理的聚苯乙烯培养皿（TCPS）上。

对于形态学研究，所有图像均在培养 48 小时后拍摄。ESEM图像使用Hitachi TM3000 ESEM在15 kV下运行，并配备了在4 °C下运行的Peltier平台。 对于该实验，细胞密度为 10,000 个细胞/孔。对于荧光图像，用Hoechst和/或phalloïdin对样品进行染色，并用荧光显微镜（AXIOLAB HBO-500，蔡司）观察。图像是用PROGSPOT软件拍摄的。细胞密度为 1,000 个细胞/孔或 50,000 个细胞/孔。

2.8 统计分析

使用社会科学统计软件包（SPSS）软件进行统计分析。对于每个人群，通过Kolmogorov-Smirnov检验检查组正态性。通过Levene检验评估组间方差的同质性，并进行单因素方差分析以检查均值之间的统计差异。最后，进行了Tukey和Scheffe的事后测试。在所有统计评价中，p < 0.05 被认为具有统计学意义。

3 结论

苯乙烯磺酸钠成功接枝到PCL薄膜表面，磺酸盐分布均匀。结果表明，该过程不会改变PCL薄膜的内在特性，并产生一层薄薄的pNaSS覆盖层，该层被发现是可靠和稳健的，因为它在孵育过程中是稳定的。尽管pNaSS层的厚度很小，但PCL的生物活性得到了改善，因为它被发现接种到嫁接的PCL薄膜上的成纤维细胞具有更好的粘附性，增强的扩散和更高的代谢活性。pNaSS的接枝可以有效地调节细胞反应，似乎是开发用于组织工程应用的生物活性聚酯基支架的良好替代方案。例如，在使用结缔组织工程的前交叉韧带重建中，最近的研究集中在开发可生物降解的结构上，这些结构可以允许功能性移植，同时增强宿主整合。根据本研究获得的结果，基于pNaSS接枝的PCL纤维的生物活性和可生物降解的假韧带可能是下一代合成韧带。pNaSS接枝到PCL纤维上的研究目前正在进行中。